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內容簡介

　　《病毒轉基因技術原理》由來自全國8所高等院校和科研院所的專傢學者閤作編寫完成。重點介紹瞭常用病毒的轉基因技術原理、純化製備技術和醫學應用現狀。力圖結閤對病毒基本生物學特性和新進展的介紹，講透病毒轉基因技術的基本問題，突齣各種不同係統的優點，探討瞭存在的問題和發展趨勢。

目錄

前言
第一章 轉基因技術概述
一、常見的基因轉移方式
二、基因轉移入真核細胞的方法
復習思考題
參考文獻

第二章 腺病毒
第一節 腺病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、微生物學檢測方法
第二節 腺病毒載體轉基因技術原理
一、腺病毒載體的發展
二、腺病毒載體的構建策略
第三節 腺病毒載體的醫學應用
一、腺病毒載體介導的基因治療
二、基於腺病毒載體的新型候選疫苗
三、展望
復習思考題
參考文獻

第三章 腺相關病毒
第一節 腺相關病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
第二節 腺相關病毒載體轉基因技術原理
一、蛋白質錶達型腺相關病毒載體
二、基因打靶型腺相關病毒載體
三、rAAV的純化和定量
第三節 腺相關病毒載體的醫學應用
一、血友病B
二、囊性縴維化
三、視網膜疾病
四、帕金森病和阿爾茨海默病
五、腫瘤
六、其他疾病
七、基因打靶
八、展望
復習思考題
參考文獻

第四章 Ⅰ型單純皰疹病毒
第一節 Ⅰ型單純皰疹病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、微生物學檢測方法
四、防治原則
第二節 HSV-1載體轉基因技術原理
一、擴增子載體
二、復製缺陷型載體
三、復製減毒型載體
四、重組HSV-1病毒粒子的純化和定量
第三節 HSV-1載體的醫學應用
一、溶瘤性治療
二、疫苗開發的應用
三、治療慢性疼痛
四、展望
復習思考題
參考文獻

第五章 莫洛尼氏鼠白血病病毒
第一節 莫洛尼氏鼠白血病病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、臨床體徵
四、診斷與防治
第二節 莫洛尼氏鼠白血病病毒載體轉基因技術原理
一、構建原理
二、逆轉錄病毒載體結構
三、包裝
四、重組病毒製備
第三節 莫洛尼氏鼠白血病病毒載體的醫學應用
一、製備轉基因動物
二、RNA乾擾
三、腫瘤治療
四、基因治療
復習思考題
參考文獻

第六章 慢病毒
第一節 HIV-1病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、微生物學檢測方法
第二節 慢病毒載體轉基因技術原理
一、以HIV-1為基礎的慢病毒載體組成
二、慢病毒載體創新設計的安全性考慮
三、重組慢病毒的産生
四、慢病毒載體製備的濃縮方法
第三節 慢病毒載體的醫學應用
一、功能基因組學
二、轉基因動物
三、細胞工程
四、基因治療
復習思考題
參考文獻

第七章 痘病毒
第一節 痘病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、微生物學檢測方法
四、治療與預防
第二節 痘病毒載體轉基因技術原理
一、常用的痘病毒載體
二、構建原理
三、重組痘病毒鑒定、純化和定量
四、重組痘病毒的安全操作
第三節 痘病毒載體的醫學應用
一、新一代抗天花疫苗/疫苗載體
二、預防傳染病
三、腫瘤基因治療
四、展望
復習思考題
參考文獻

第八章 杆狀病毒
第一節 杆狀病毒簡介
一、分類
二、病毒結構
三、病毒復製
第二節 杆狀病毒載體轉基因技術原理
一、杆狀病毒錶達係統的基本特徵
二、杆狀病毒錶達係統基本原理及構建原則
三、杆狀病毒錶達係統重要技術要點
四、杆狀病毒錶達係統的改進
第三節 杆狀病毒載體的醫學應用
一、錶達外源蛋白
二、杆狀病毒錶麵展示
三、基因治療
四、抗體與疫苗
五、基因工程病毒殺蟲劑
六、展望
復習思考題
參考文獻

第九章 甲病毒
第一節 甲病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性
第二節 甲病毒載體轉基因技術原理
一、甲病毒錶達載體的構建
二、甲病毒錶達載體的轉染
第三節 甲病毒載體的醫學應用
一、蛋白質錶達
二、腫瘤疫苗與腫瘤治療
三、靶嚮性基因治療
四、展望
復習思考題
參考文獻

第十章 仙颱病毒
第一節 仙颱病毒簡介
一、生物學特性
二、緻病性與免疫性
三、微生物學檢測方法
第二節 仙颱病毒載體轉基因技術原理
一、構建原理
二、發展方嚮
第三節 仙颱病毒載體的醫學應用
一、減毒活疫苗
二、治療肢端缺血
三、治療腫瘤
四、細胞核重編程誘導多能乾細胞
五、其他應用
復習思考題
參考文獻

第十一章 生物安全
第一節 生物安全實驗室與轉基因生物安全
一、生物安全實驗室
二、病原微生物分類
三、實驗室轉基因技術生物安全
第二節 基因治療生物安全
一、載體安全性
二、錶達産物安全性
三、關於基因治療和病毒載體活疫苗生物安全的要求
復習思考題
參考文獻

第十二章 臨床試驗倫理
一、基因治療的倫理學問題
二、病毒載體疫苗的倫理學問題
復習思考題
參考文獻
附錄 常用的網址

精彩書摘

　　《病毒轉基因技術原理》：
　　第一章 轉基因技術概述
　　在自然界，生命的種類繁多且復雜。盡管生命的遺傳性狀在不同種類或同種不同個體間是有差異的，但相對穩定。在特定的條件下，遺傳性狀可因突變、基因轉移（genetransfer）等而發生不同程度的改變。基因轉移現象在自然界的生物體中非常常見。在原核細胞型微生物，基因的轉移常采用轉化、接閤、轉導、溶源性轉換和原生質體融閤等方式進行，可賦予受體生物新的生物學性狀，如形態結構、耐藥性、毒力和抗原性等的改變。而在非細胞型微生物，如病毒，可發生病毒基因組之間的重組和重配，或基因産物的互補和錶型混閤等；此外，部分腫瘤相關病毒的基因組可以整閤到病毒感染的宿主細胞染色體中，造成宿主細胞基因組發生變異，甚至惡性轉化。轉基因技術，就是基於自然界中常見的基因轉移現象，人為地加以利用，用於不同生命體之間基因轉移，尤其是將外源基因轉移入真核細胞，用以研究生命科學的基本現象和機製、基因工程産品製備、基因治療、疾病預防和動物模型製備等，為人類的健康事業做齣貢獻。
　　一、常見的基因轉移方式
　　（一）轉化
　　早在1928年，Frederick在研究肺炎鏈球菌時，昀先報道瞭細菌的轉化（transformation）現象。將有莢膜的、菌落呈光滑（S）型的Ⅲ型肺炎鏈球菌注射至小鼠體內，小鼠死亡，從死鼠血中可分離到Ⅲ型肺炎鏈球菌。將無莢膜的、菌落呈粗糙（R）型的Ⅱ型肺炎鏈球菌，或將ⅢS型菌加熱殺死後再注射小鼠，則小鼠存活。但如將熱殺死的ⅢS型菌與活的ⅡR型菌混閤在一起注射小鼠，則小鼠死亡，並從死鼠血中分離齣活的ⅢS型菌。這錶明活的ⅡR型菌從死的ⅢS型菌中獲得瞭産生ⅢS型菌莢膜的遺傳物質，使活的ⅡR型菌轉化為ⅢS型菌。1944年，Avery等用提取的ⅢS型菌的DNA片段代替熱殺死的ⅢS型菌，與活的ⅡR型菌一起注射小鼠，仍導緻小鼠死亡，且從死鼠血中分離到ⅢS型菌。終於證實引起ⅡR型菌轉化的物質是ⅢS型菌的DNA。這就是著名的小鼠體內肺炎鏈球菌的轉化實驗。
　　現在，轉化因此而被定義為：受體菌直接攝取供體菌遊離的DNA片段，並將其整閤到自己菌體基因中去，從而使受體菌獲得供體菌新的遺傳性狀的過程。轉化可以分為自然轉化和人工轉化兩種。自然轉化強調的是細菌隻要處於感受態（competence）這一特殊的生理狀態，即可攝取外源的綫性染色體DNA分子和質粒。感受態的齣現時間和持續時間因菌種而異。除肺炎鏈球菌外，其他細菌如流感嗜血杆菌、葡萄球菌和芽孢杆菌等均具有自然轉化的能力。人工轉化則是通過人為的方法，如低溫CaCl2法誘導細菌處於感受態，使細菌具有攝取DNA的能力，或電穿孔法人為地將DNA導入菌體內，為不具有自然轉化能力的很多細菌提供瞭一條獲取外源DNA的途徑，並且也是目前基因工程的基礎技術之一。
　　（二）轉導
　　1951年，Joshua和Norton發現瞭噬菌體介導的基因轉移方式——轉導（transduction）。用兩株具不同的多重營養缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌混閤培養後，基本培養基上長齣原養型菌落，證實瞭該菌中存在重組現象。繼續用Davis的“U”形管實驗證實這一過程是否需要細胞間的直接接觸。“U”形管中間隔有濾闆，隻允許培養基通過而細菌不能通過。其兩臂裝入完全培養基，將兩株營養缺陷型菌株分彆接種到“U”形管兩臂進行培養後，在供體和受體細菌不接觸的情況下，同樣齣現原養型細菌。錶明這一重組過程並不需要細菌的直接接觸。仔細檢查後發現所用的沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌，另一株是非溶源性細菌，因此可透過“U”形管濾闆的應該是P22噬菌體並進行著基因的傳遞。
　　現在，轉導被定義為以溫和噬菌體為媒介，將供體菌的DNA片段轉移到受體菌內，使受體菌獲得新的遺傳性狀的過程。轉導在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均可發生。依據噬菌體和宿主菌關係，可把噬菌體分為毒性噬菌體和溫和噬菌體。隻有溫和噬菌體能介導細菌的轉導。根據DNA片段涉及的範圍，轉導可分為普遍性轉導和局限性轉導兩種。普遍性轉導是指噬菌體可以轉導供體菌染色體的任何部分到受體菌中；而局限性轉導是指噬菌體隻能攜帶前噬菌體整閤在染色體兩側的基因片段到受體菌中。
　　（三）轉染
　　通常，感染（infection）被定義為病原體通過自然的途徑進入動物或人體，突破宿主的防禦機製並引起不同程度的病理過程。在感染涉及的病原體中，病毒是非常具有特徵性的一類病原體，屬於非細胞型微生物，在自然界的分布非常廣泛，可在人、動物、植物、昆蟲、真菌和原核細胞型微生物中寄居並引起感染。病毒體積微小，結構非常簡單，僅含一種類型的核酸，因此必須在活細胞內寄生以完成其復製周期。利用病毒專一性活細胞寄生及部分病毒整閤感染的特點，對病毒的基因組進行分子遺傳學改造，設計齣基因工程病毒載體。這種利用病毒載體將外源基因轉移入真核細胞的過程稱轉染（transfection），以便與病毒的自然感染過程相區彆（圖1-1）。近年來，轉染的廣義概念是指外源基因通過非病毒載體轉基因技術（物理、化學方法）或病毒載體轉基因技術的方法進入真核細胞的過程。
　　二、基因轉移入真核細胞的方法
　　（一）基因轉移入真核細胞的影響因素
　　原核生物如細菌，為瞭防止外源DNA的入侵，其體內的限製性內切核酸酶會將外源DNA水解成不同的片段，而同時對自己的核酸相應的酶切位點進行甲基化修飾，保護自己的基因不受自己酶的破壞，這就是細菌的限製-修飾係統（restriction-modificationsystem）。如果是質粒參與的基因轉移，依據質粒復製時對宿主的依賴程度，可分為窄宿主譜質粒和寬宿主譜質粒；兩種以上的質粒在同一宿主中還存在相容性和不相容性的
　　圖1-1野生型病毒的自然感染、病毒載體轉染和質粒經化學法介導的轉染
　　問題，這些因素會影響質粒在宿主菌中的穩定性。外源基因進入受體菌，必須依賴RecA蛋白與受體細菌同源序列之間發生同源重組；或不依賴RecA蛋白和同源序列發生非同源重組，從而讓受體菌獲得新的遺傳性狀。
　　外源基因進入真核細胞的影響因素與上述原核生物有顯著差彆。真核細胞具有不同的膜樣結構，如細胞膜將細胞與外環境隔離開來，隻允許特定的物質進行膜內外的交換；細胞核膜將細胞核和細胞內環境隔離開來；細胞器膜將細胞內環境的不同功能空間隔離開來。因為外源基因的化學性質是DNA，為大分子質量的物質，並且對核酸酶非常敏感。外源基因進入真核細胞，要突破三大障礙因素。首先是必須到達細胞膜的錶麵，其次是如何突破細胞膜進入細胞質，昀後是如何進入細胞核並啓動外源基因的錶達。理想的轉基因技術方法必然包括以下幾個方麵：能夠保護外源基因不被核酸酶降解、能輸送外源基因到達細胞膜錶麵、有利於外源基因跨過細胞膜並促進其進入細胞核。
　　（二）外源基因轉移入真核細胞的類型和方法
　　外源基因進入真核細胞的類型包括質粒型載體和病毒顆粒型載體兩類，後者即病毒介導的轉基因技術，可分為假型病毒載體和重組型病毒載體兩種。
　　質粒型載體是將外源基因剋隆入含有真核細胞（病毒）復製子的真核細胞錶達質粒，既可在大腸杆菌中傳代，也能在允許真核細胞中以染色體外質粒的形式復製和錶達外源基因，但不會産生感染性病毒顆粒。對於這種類型的載體進入真核細胞，常用物理（錶1-1）和化學的方法（錶1-2）。
　　……

前言/序言

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