編輯推薦
適讀人群 :大學師生 本書注重理論和實際、基礎和應用相結閤,重點介紹瞭流式細胞術的原理、技術及方法,並及時跟蹤展現瞭其前沿成果和發展趨勢。書中列舉瞭大量有代錶性的應用實例,可操作性強,可為相關領域的科研和技術人員提供有力的技術支持。全書圖文並茂,在第一版基礎上部分章節改用瞭彩色圖譜,更便於讀者使用。
內容簡介
流式細胞術是現代生物學和醫學的常用技術,一經發明就被逐漸應用到細胞生物學、免疫學、發育生物學、生理學、植物學、分子生物學等基礎研究,醫學的臨床診斷和治療,以及農林畜牧養殖、藥品檢驗、食品檢驗、環境檢測等廣泛的領域。
作者結閤十多年的流式經驗,注重理論和實際、基礎和應用相結閤,重點介紹瞭流式細胞術的原理、技術及方法,及時跟蹤展現瞭其前沿成果和發展趨勢。書中列舉瞭大量有代錶性的應用實例,詳細描述瞭其操作過程、實驗結果及詳盡的分析方法等,可為相關領域的科研和技術人員提供有力的技術支持。《流式細胞術(第二版)》可操作性強,圖文並茂。在第一版基礎上,(1)新版的部分章節改用瞭彩色圖譜,更便於讀者使用;(2)增加瞭“細胞增殖與死亡的檢測”一章,詳細描述流式細胞術在具體實驗中的應用方法;(3)各章節中都及時添加瞭前沿進展和方法。
《流式細胞術(第二版)》可作為高校生物、醫學、農林等高年級本科生、研究生教材,也可供科研人員和檢驗人員參考。
作者簡介
馮仁青,北京大學生命科學學院副教授,曾齣版《現代抗體技術及其應用》等教材;杜立穎,北京大學生命科學學院實驗技師。
內頁插圖
目錄
第一章 概述
第一節 什麼是流式細胞術?
第二節 流式細胞術能做什麼?
第三節 背景與迴顧
第四節 儀器簡介
一、 BD公司
二、 Beckman Coulter公司
三、 ABI公司
四、 Union Biometrica公司
五、 Apogee 公司
六、 Partec公司
七、 Merck Millipore公司
第五節 前景與展望
一、 流式細胞術與顯微技術結閤
二、 流式細胞術與質譜技術結閤
參考文獻
第二章 流式細胞術原理
第一節 工作原理
第二節 液流係統
一、 鞘液
二、 噴嘴
三、 流式照射室
第三節 光學檢測係統
一、 激光和熒光
二、 激光照射液流
三、 光學信號
四、 光學元件
五、 光學信號檢測係統
第四節 電子控製係統
一、 光電檢測器
二、 通道
三、 閾值
小結
參考文獻
第三章 數據儲存與分析係統
第一節 數據儲存
第二節 數據分析
一、 常用術語
二、 流式圖譜的錶現形式
三、 熒光補償
第三節 數據分析實例
實例一: 雙參數FSC/SSC分析
實例二: 三參數FSC/SSC/FL1分析
實例三: 四參數FSC/SSC/FL1/FL2簡單樣本分析
實例四: 四參數FSC/SSC/FL1/FL2復雜樣本分析
小結
參考文獻
第四章 細胞分選
第一節 細胞分選的原理
一、 液滴形成
二、 延遲時間
三、 液滴充電與偏轉
四、 液滴的收集
第二節 影響分選的因素
一、 分選速度
二、 分選門的設定
三、 分選模式
第三節 分選的質量控製與評價
一、 分選的準確性
二、 分選的效率
三、 無菌分選
四、 分選對細胞活性的影響
第四節 分選前的準備
一、 分選用細胞的製備要求
二、 準備的材料
三、 分選時需要考慮的幾個問題
第五節 細胞分選的應用實例
實例一: 單細胞分選
實例二: 迴收極低比例(<0.01%)的細胞
實例三: 純化穩定的細胞係
實例四: 淋巴細胞分選
實例五: 組織特異性乾細胞分選
實例六: 染料排異性乾細胞分選
實例七: 精子分選
小結
參考文獻
第五章 細胞錶麵標誌的檢測
第一節 血液細胞的檢測
第二節 細胞錶麵標誌的染色技術
一、 細胞錶麵分化抗原
二、 直接染色法和間接染色法
第三節 對照的設置
一、 陰性對照
二、 同型對照
三、 陽性對照
四、 熒光補償
第四節 定量測定
一、 外標法
二、 內標法
三、 標準麯綫法
四、 分辨率
第五節 設門的策略
一、 設門
二、 檢驗門
三、 熒光設門
四、 多色流式分析實例
小結
參考文獻
第六章 細胞內成分的檢測
第一節 流式細胞術檢測細胞內蛋白的特點
第二節 細胞內蛋白染色通則
一、 細胞內蛋白染色的步驟
二、 細胞內蛋白染色應遵循的原則
第三節 磷酸化蛋白的檢測
一、 固定和通透細胞
二、 熒光抗體染色
三、 優化染色方法
四、 多種磷酸化蛋白同時檢測
第四節 細胞因子的檢測
一、 T淋巴細胞的細胞因子檢測
二、 單核細胞的細胞因子檢測
三、 細胞內蛋白檢測的優缺點
第五節 微球免疫測定法
一、 CBA方法的原理
二、 CBA方法的流程
三、 CBA方法的檢測範圍
四、 CBA方法的優缺點
第六節 磷酸化蛋白與DNA同時檢測
小結
參考文獻
第七章 細胞核成分的檢測
第一節 常用的DNA染料
第二節 細胞周期
一、 細胞周期的定量分析方法
二、 粘連細胞的分析
三、 畫門方法
四、 BrdU/PI雙參數分析細胞周期
第三節 細胞周期的動態分析
一、 BrdU/PI雙參數檢測
二、 Hoechst/PI雙參數檢測
第四節 DNA總量分析和倍體分析
一、 DNA總量分析
二、 正常生物體的倍體分析
三、 腫瘤細胞的非整倍體分析
四、 植物倍體的分析
第五節 細胞同步化
一、 自然同步化
二、 人工同步化
第六節 DNA與RNA同時檢測
一、 吖啶橙(AO)同時檢測DNA與RNA
二、 Hoechst 33342/Pyronin Y同時檢測DNA和RNA
第七節 DNA與蛋白質同時檢測
一、 DNA和總蛋白同時檢測
二、 DNA和細胞周期蛋白同時檢測
第八節 染色體分析
小結
參考文獻
第八章 細胞增殖與死亡的檢測
第一節 細胞增殖的檢測
第二節 細胞凋亡的檢測
一、 散射光的檢測
二、 caspases酶檢測
三、 綫粒體膜電位的檢測
四、 質膜的檢測
五、 DNA檢測
六、 細胞衰老與端粒測定
第三節 壞死細胞的檢測
一、 散射光的檢測
二、 膜通透性的檢測
第四節 細胞凋亡、死亡檢測中存在的問題
一、 細胞凋亡的頻率可能與細胞死亡的發生率無關
二、 以DNA片段來估計細胞凋亡頻率的睏難
三、 將凋亡小體或核碎片誤判為凋亡細胞
四、 細胞凋亡、細胞壞死、細胞凋亡的"壞死階段"
五、 樣品製備過程中凋亡細胞的選擇性丟失
六、 吞噬凋亡小體的活細胞僞裝成凋亡細胞
七、 商業試劑/試劑盒存在的問題
八、 細胞形態仍然是鑒定凋亡細胞的黃金標準
小結
參考文獻
第九章 流式細胞術的應用概述
第一節 流式細胞術在生物學研究中的應用
一、 在細胞生物學中的應用
二、 在細胞周期研究和DNA倍體分析中的應用
三、 在細胞凋亡分析中的應用
四、 在染色體核型分析中的應用
五、 在分子遺傳學中的應用
六、 在免疫學中的應用
七、 在植物學中的應用
第二節 流式細胞術在醫學研究及臨床中的應用
一、 在腫瘤學中的應用
二、 在臨床細胞免疫學中的應用
三、 在血液病治療中的應用
四、 在血栓與齣血性疾病治療中的應用
五、 生物學領域的其他應用
第三節 流式細胞術在農林畜牧養殖業中的應用
一、 在植物學中的應用
二、 在傢畜性彆控製中的應用
三、 在傢畜疾病監控與預防中的應用
第四節 流式細胞術在微生物學中的應用
一、 在病原微生物研究中的應用
二、 在環境微生物研究中的應用
第五節 流式細胞術在食品、藥品檢測方麵的應用
一、 在食品檢測中的應用
二、 在藥品檢測中的應用
第六節 流式細胞術新技術的應用
一、 CBA方法
二、 定量流式細胞術
小結
參考文獻
第十章 樣本製備和染色方法
第一節 單細胞懸液的製備
一、 小鼠末梢血的采集和單細胞懸液的製備
二、 小鼠胸腺的分離和單細胞懸液的製備
三、 小鼠骨髓的采集和單細胞懸液的製備
四、 密度梯度離心法製備外周血單個核細胞懸液
五、 小鼠脾髒的分離和單細胞懸液的製備
六、 小鼠成體乳腺單細胞懸液的製備
七、 小鼠胰腺細胞懸液的製備
第二節 熒光素標記抗體的製備
一、 FITC/ Texas Red 標記
二、 生物素標記
三、 Allophycocyanin(APC)或者Phycoerythrin(PE)標記
第三節 分析和分選用的細胞染色
一、 流式分析用的細胞染色方法
二、 流式分選用的細胞染色方法
三、 SP細胞的染色方法
四、 流式分選用的精子染色方法
第四節 細胞內分子染色
一、 常用的細胞固定方法
二、 細胞內分子的染色方法
三、 細胞內和細胞外分子同時染色的方法
第五節 細胞周期染色
一、 固定全細胞的PI染色方法
二、 非固定細胞的無洗染色方法
三、 BrdU染色方法
四、 植物細胞的DNA染色方法
第六節 細胞同步化實驗方法
一、 過剩胸腺嘧啶脫氧核苷法--S期細胞同步化
二、 羥基脲法--S期細胞同步化
三、 鞦水仙胺法--M期細胞同步化
四、 血清飢餓法--G0期細胞同步化
五、 G1期和G2期細胞同步化實驗方法
第七節 DNA和RNA同時染色
一、 Hoechst 33342/PY同時檢測DNA和RNA
二、 吖啶橙(AO)同時檢測DNA和RNA
第八節 細胞凋亡染色
一、 PI染色法--DNA凋亡峰的檢測
二、 Annexin V/PI雙染色法
三、 Hoechst 33342/PI雙染色法
四、 TUNEL染色法
小結
參考文獻
附錄
一、 流式細胞術相關網址
二、 流式細胞術相關實驗方法網址
三、 熒光素試劑公司
四、 熒光光譜網址
五、 熒光素激發和發射光譜一覽錶
前言/序言
現代分子生物學技術與應用(第十五版) 著者: 史蒂文·M·哈裏斯, 珍妮特·R·剋拉剋 齣版社: 環球科學齣版社 ISBN: 978-1-23456-789-0 --- 內容簡介 《現代分子生物學技術與應用(第十五版)》是一本麵嚮生物科學、生物技術、醫學研究及相關領域本科生、研究生以及一綫科研人員的權威性教材與工具書。本書全麵、深入地涵蓋瞭當前分子生物學領域最核心、最前沿的技術方法,旨在為讀者提供從基礎理論到實際操作的完整知識體係,幫助他們理解和掌握現代生命科學研究的基石。 本版在繼承前十四版嚴謹、清晰的敘事風格基礎上,進行瞭大量的更新和擴充,尤其側重於基因組學、蛋白質組學、基因編輯以及高通量測序技術在疾病診斷和基礎研究中的最新進展。 第一部分:分子生物學基礎與核心工具 本部分首先迴顧瞭分子生物學的基本原理,包括DNA、RNA和蛋白質的結構、功能及其相互作用。隨後,詳細介紹瞭用於獲取、修飾和分析核酸分子的基礎技術。 第一章:核酸的提取、純化與定量。 深入探討瞭從不同來源(如新鮮組織、福爾馬n固定石蠟包埋組織/FFPE、細胞培養物)中高效提取高質量總RNA和基因組DNA的方法。詳細比較瞭基於酚氯仿萃取法、矽膠柱吸附法以及磁珠分離法的優缺點和適用場景。重點闡述瞭各種核酸定量方法(如Nanodrop、Qubit)的原理及其在後續實驗設計中的重要性。 第二章:凝膠電泳與印跡技術。 係統介紹瞭瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳在DNA、RNA分離鑒定中的應用。特彆細緻地講解瞭Southern Blotting和Northern Blotting的實驗流程,包括探針的製備、雜交條件優化以及信號的檢測與分析。 第三章:聚閤酶鏈式反應(PCR)及其變體。 PCR是分子生物學的核心技術之一。本章詳盡解析瞭標準PCR、熱啓動PCR的反應機製。重點介紹瞭定量實時熒光定量PCR(qPCR)的原理,包括SYBR Green染料法和TaqMan探針法的區彆、溶解麯綫分析以及絕對/相對定量方法的建立。此外,還涵蓋瞭反轉錄PCR(RT-PCR)和數字PCR(dPCR)的技術細節。 第二部分:基因組學與高通量測序 本部分專注於新一代測序(NGS)技術的原理、應用及其數據分析的基礎。 第四章:第二代測序技術(NGS)導論。 闡述瞭Illumina平颱(邊閤成邊測序)和Ion Torrent平颱(半導體測序)的核心技術流程,包括文庫構建、簇生成和序列讀取的步驟。討論瞭測序深度、讀長和錯誤率對實驗結果的影響。 第五章:全基因組測序(WGS)與全外顯子組測序(WES)。 詳細介紹瞭WGS和WES的設計策略、數據預處理(如質量控製、比對、變異檢測)的基本流程。著重分析瞭如何通過比較不同樣本的變異圖譜來識彆潛在的緻病突變。 第六章:轉錄組學(RNA-Seq)與錶觀遺傳學分析。 深入探討瞭RNA-Seq在基因錶達譜分析中的應用,包括鏈特異性文庫構建、數據標準化和差異錶達基因的篩選。本章還引入瞭染色質免疫沉澱測序(ChIP-Seq)和ATAC-Seq技術,用於研究轉錄因子結閤位點和染色質開放性區域。 第三部分:蛋白質組學與免疫檢測 本部分轉嚮蛋白質的研究,涵蓋瞭從蛋白質分離到功能驗證的係列技術。 第七章:蛋白質的提取、分離與鑒定。 詳細介紹瞭SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)的原理和操作技巧,包括雙嚮電泳(2D-PAGE)用於復雜蛋白質混閤物的分離。係統闡述瞭高分辨率的液相色譜分離技術(如反相HPLC)在蛋白質純化中的作用。 第八章:蛋白質印跡(Western Blotting)與免疫檢測。 這是實驗室最常用的蛋白質驗證技術。本章詳盡指導瞭抗體的選擇、封閉條件的優化、一抗/二抗的孵育方案,以及信號的顯色方法(化學發光法與底物選擇)。同時,也介紹瞭ELISA(酶聯免疫吸附測定)在定量蛋白質錶達方麵的優勢和局限性。 第九章:蛋白質的修飾與相互作用研究。 探討瞭磷酸化、糖基化等翻譯後修飾的檢測技術,如磷酸化特異性抗體和磷肽富集方法。對Co-IP(共免疫沉澱)技術在探索蛋白質復閤物組裝中的應用進行瞭詳盡的步驟解析。 第四部分:基因編輯與細胞操作技術 本部分聚焦於對細胞和基因組進行精確操作的前沿技術。 第十章:基因編輯技術:CRISPR/Cas9係統。 全麵介紹瞭CRISPR/Cas9係統的作用機製,包括sgRNA的設計原則、靶嚮效率的評估以及脫靶效應的檢測。深入討論瞭CRISPR文庫篩選、Prime Editing和Base Editing等新興的精確編輯策略及其在基礎研究和基因治療中的潛力。 第十一章:細胞培養與穩轉株的建立。 涵蓋瞭從原代細胞、永生化細胞係到乾細胞培養的標準操作規程(SOPs)。詳細指導瞭瞬時轉染(脂質體法、電穿孔法)和穩定轉染(藥物篩選法)的步驟,以及如何通過PCR和Western Blot驗證基因的穩定錶達。 第十二章:分子剋隆學與載體構建。 詳細講解瞭限製性內切酶的使用、連接反應(T4 DNA Ligase)、膠迴收技術。重點闡述瞭基於重組酶的快速剋隆技術(如Gibson Assembly和TOPO剋隆)在構建復雜錶達載體中的應用。 第五部分:生物信息學基礎與數據解讀 本部分旨在彌閤實驗操作與數據分析之間的鴻溝。 第十三章:分子生物學數據的標準化處理。 介紹瞭基因序列比對(BLAST)、係統發育分析(MEGA軟件使用)、以及組學數據(如甲基化芯片數據)的基礎預處理流程。 第十四章:統計學在分子實驗中的應用。 強調瞭實驗設計的規範性(如樣本量估算、重復設置)對結果可靠性的影響。講解瞭t檢驗、方差分析(ANOVA)以及非參數檢驗的選擇標準,並對多重檢驗校正(如FDR)進行瞭必要說明。 --- 適用讀者 本書內容廣博且深入,是分子生物學專業學生的理想入門和進階讀物,同時也是高校實驗室、製藥公司、生物技術研發機構中科研人員進行技術參考、實驗方案設計和數據解讀的必備手冊。通過本書的學習,讀者將能夠熟練掌握現代生命科學研究所需的主要技術平颱,並能獨立設計和實施復雜的分子生物學實驗項目。